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直播答疑 | 間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化

更新時(shí)間:2024-04-29  |  點(diǎn)擊率:734

在4月17日普諾賽直播間中,徐老師從誘導(dǎo)分化步驟、細(xì)胞狀態(tài)及密度、試劑配置及保存、誘導(dǎo)結(jié)果展示4個(gè)方面為大家詳細(xì)介紹了間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化。直播回放請(qǐng)點(diǎn)擊微信公眾號(hào)菜單欄【資料中心】-【往期直播回放】查看,或在B站搜索“普諾賽生物",點(diǎn)擊最新視頻觀看學(xué)習(xí)。


本期直播答疑,我們從直播間幾十個(gè)提問中,篩選出部分代表性問題,并做了詳細(xì)解答。若有其他問題,歡迎大家在推文底部留言,或點(diǎn)擊微信公眾號(hào)菜單欄【快速查詢】-【在線咨詢】,我們將在線解答。






1

成脂誘導(dǎo)前不需要接觸抑制2天嗎?有的文獻(xiàn)說必須要接觸抑制細(xì)胞才能分化。

可根據(jù)當(dāng)前的細(xì)胞狀態(tài)以及使用的誘導(dǎo)試劑來決定是否接觸抑制;

使用普諾賽的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞時(shí),不需要接觸抑制2天。在細(xì)胞接種后,密度達(dá)到95%-100%時(shí),即可開始誘導(dǎo);

誘導(dǎo)期間細(xì)胞是在緩慢增殖和誘導(dǎo)分化的。在這個(gè)過程中,細(xì)胞會(huì)逐漸退出生長(zhǎng)期,同時(shí)也保證了細(xì)胞處于最佳狀態(tài)開始分化。




2

2.油紅O染色液過濾用什么濾紙?

使用0.22 μm或0.45 μm的尼龍材質(zhì)濾膜或中性濾紙進(jìn)行過濾,去除油紅O染色液中的雜質(zhì)。




3

AB液培養(yǎng)交替時(shí),需要用PBS充分洗滌嗎?推薦的洗滌次數(shù)是?

在成脂誘導(dǎo)過程中,A液和B液交替換液;

換液時(shí),可以用PBS洗滌細(xì)胞1次,但需要注意操作時(shí)清洗細(xì)胞的次數(shù)越多,越容易造成細(xì)胞卷邊漂浮;

若操作熟練且細(xì)胞狀態(tài)較好,可以盡可能的吸去A液,然后再沿著孔壁緩慢加入預(yù)熱好的新鮮B液,反之亦然;若操作不熟練,可嚴(yán)格按照以下操作:用PBS 清洗細(xì)胞1次,換液時(shí)可先吸出大部分培養(yǎng)基或PBS緩沖液丟棄,留少量原液在孔板內(nèi)作為緩沖,接著沿孔壁緩慢加入要更換的預(yù)熱新鮮培養(yǎng)基。




4

3T3細(xì)胞可以用于成脂誘導(dǎo)嗎?誘導(dǎo)流程是和間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)的一樣嗎?MC3T3-E1細(xì)胞也是按照間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)步驟進(jìn)行誘導(dǎo)嗎?

3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)細(xì)胞可進(jìn)行成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),普諾賽也有配套的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(貨號(hào):PD-031),具體步驟可以參考配套誘導(dǎo)分化試劑的說明書;

MC3T3-E1 Subclone 14 (小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14)細(xì)胞可用于成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),普諾賽也有配套的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(貨號(hào):PD-033),具體步驟可以參考配套誘導(dǎo)分化試劑的說明書。




5

在誘導(dǎo)過程中拍照要打開蓋子嗎?如何通過觀察細(xì)胞,后續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)條件調(diào)整?

如果是在誘導(dǎo)過程中拍照觀察細(xì)胞狀態(tài),請(qǐng)不要打開蓋子,防止細(xì)胞污染,影響后續(xù)細(xì)胞的狀態(tài);

誘導(dǎo)過程中可通過鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),比如細(xì)胞是否出現(xiàn)卷邊漂浮、碎裂、污染等情況來判斷誘導(dǎo)過程是否順利;

若誘導(dǎo)過程中,細(xì)胞出現(xiàn)輕微卷邊現(xiàn)象,在換液過程中要更加輕柔,可留少量原液作為緩沖,培養(yǎng)基37℃復(fù)溫后再使用;或者使用包被過的孔板進(jìn)行誘導(dǎo),增強(qiáng)細(xì)胞的吸附性,減少卷邊漂浮的情況;

若發(fā)現(xiàn)污染情況,請(qǐng)立即排查試劑、耗材等污染源,小心處理已經(jīng)污染的板子,防止污染其他孔板;

實(shí)驗(yàn)開始時(shí),建議多做幾個(gè)單獨(dú)孔板的重復(fù)組。在誘導(dǎo)后期,可通過鏡下觀察和染色來判斷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)是否成功。




6

舊包裝誘導(dǎo)劑的哪些成分需要-20℃保存?也是不能反復(fù)凍融的嗎?

舊包裝的誘導(dǎo)試劑保存條件可參照說明書和試劑管上標(biāo)簽備注的保存條件進(jìn)行保存;

舊包裝的成骨誘導(dǎo)試劑中:FBS、谷氨酰胺、青鏈霉素、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和地塞米松B均需要-20℃保存;不建議反復(fù)凍融,若一次用不完可分裝后凍存;

舊包裝的成脂誘導(dǎo)試劑中:FBS、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰島素、IBMX、羅格列酮和地塞米松A均需要-20℃保存;不建議反復(fù)凍融,若一次用不完可分裝后凍存;

舊包裝的成軟骨誘導(dǎo)試劑中:丙酮酸鈉、ITS添加物、TGF-β3、抗壞血酸、脯氨酸、地塞米松B和青鏈霉素均需要-20℃保存;不建議反復(fù)凍融,若一次用不完可分裝后凍存。




7

成骨的各種試劑也需要預(yù)熱嗎?

成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配置完成后,使用前需37℃復(fù)溫半小時(shí)以上,手感溫?zé)峒纯墒褂?/span>。預(yù)熱的主要目的是為了避免過大溫差對(duì)細(xì)胞造成刺激,導(dǎo)致細(xì)胞收縮、卷邊甚至脫壁,影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。




8

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基自己配制好配嗎?

如果購買的是普諾賽配套的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,可按照說明書的配比添加相應(yīng)成分配置即可,配置簡(jiǎn)單。如果是參考文獻(xiàn)中的配方自己配置誘導(dǎo)試劑,這個(gè)誘導(dǎo)效果就不好評(píng)估了,建議配置后先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下誘導(dǎo)效果。




9

為什么要包被呢?細(xì)胞誘導(dǎo)久了容易聚集怎么解決呢?

包被是為了增強(qiáng)器皿的吸附性,從而使細(xì)胞能夠更好地展開,貼壁更牢,有效預(yù)防在誘導(dǎo)過程中細(xì)胞出現(xiàn)卷邊或漂浮的情況;

若細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)了,出現(xiàn)聚集的情況,老師在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)可注意提前包被孔板、控制初始細(xì)胞接入量、細(xì)胞鋪板均勻、換液輕柔、培養(yǎng)基復(fù)溫等細(xì)節(jié),盡量減少對(duì)細(xì)胞的刺激。




10

拍照有什么注意事項(xiàng)嗎?

在誘導(dǎo)過程中拍照時(shí),請(qǐng)確保調(diào)整好焦距,并選擇合適的位置來拍攝不同倍鏡下的細(xì)胞圖片;

染色后拍照時(shí),請(qǐng)注意不同顯微鏡可能拍出略有差異的顏色。因此,需要仔細(xì)觀察鏡下顏色,確定拍出的染色圖沒問題。同時(shí)清洗完染液后,可留適量的PBS,以減少光圈的出現(xiàn),從而呈現(xiàn)出更好的效果圖。




11

成軟骨誘導(dǎo)完成后,進(jìn)行包埋切片,切片是切多少微米的呢?我的球每次培養(yǎng)都很小,直徑都沒有1mm不知道是不是正常的,切片也只能切兩三片,掃描也看不清楚,是為什么呢?

軟骨球切片厚度為3~5 μm,誘導(dǎo)結(jié)束后的軟骨球直徑大概在1~2 mm左右;

開始誘導(dǎo)的細(xì)胞量需要嚴(yán)格控制在2.5~3*105 cells/0.5 mL/管;

細(xì)胞量太多的話,球過大,誘導(dǎo)過程中可能會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞死亡,球破裂;細(xì)胞量太少的話可能難以形成球,即便形成了較小的軟骨球,后續(xù)操作也不好進(jìn)行;

培養(yǎng)的球直徑比較小,可能原因是初始細(xì)胞量較少、誘導(dǎo)時(shí)間短、沒有誘導(dǎo)成功等。切片厚度可以控制在4 μm,切片正常的話,肉眼可觀察到有一個(gè)很小的軟骨球片,呈小圓餅狀,染色后肉眼可見更加明顯。




12

這三個(gè)誘導(dǎo),原代細(xì)胞都要用3代以內(nèi)細(xì)胞么?

原代細(xì)胞是組織現(xiàn)提取分離的,體外培養(yǎng)代次有限,且隨著細(xì)胞代次的增加,細(xì)胞的增殖速度以及狀態(tài)也會(huì)慢慢變差。建議使用三代以內(nèi)的細(xì)胞開始誘導(dǎo),在細(xì)胞狀態(tài)最佳的時(shí)候進(jìn)行實(shí)驗(yàn),做出來的結(jié)果也會(huì)相對(duì)更好。




13

人細(xì)胞的成軟骨分化試劑盒可以用于小鼠的細(xì)胞嗎?

建議使用對(duì)應(yīng)種屬的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,效果最-佳。但也有相關(guān)資料顯示,成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對(duì)種屬的要求沒有那么嚴(yán)格,一般人的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基也可以用于小鼠。然而誘導(dǎo)過程中的影響因素較多,如果混用的話,建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。




14

成軟骨的鑒定,除了染色,有沒有什么特異的靶標(biāo)?

軟骨結(jié)構(gòu)復(fù)雜,主要是由一些基質(zhì)成分組成,包括II 型、IX 型、X I型膠原和一些蛋白多聚糖,其中以II型膠原(Collagen II)和糖胺聚糖為主。成軟骨誘導(dǎo)過程中會(huì)生成蛋白多聚糖和Collagen II等細(xì)胞外基質(zhì),可通過免疫熒光染色、甲苯胺藍(lán)/阿利辛藍(lán)染色、qRT-PCR 檢測(cè)成軟骨特異指標(biāo)Ⅱ型膠原、蛋白多糖和成軟骨轉(zhuǎn)錄因子 SOX9 的基因表達(dá)及蛋白合成情況,具體可參考文獻(xiàn)。